锌离子对细菌转录组学影响：铝离子缓解铝诱导大豆根尖氧化胁迫以及基因表达量的影响

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众所周知，当植物受到不同的环境胁迫，在代谢过程中Al毒会激发植物组织会产生大量的活性氧，包括O2、H2O2等，这些有毒的代谢产物具有较高反应活性，能够降低酶的活性，损伤植物内大分子物质和细胞内的细胞器同时破坏脂类物质。

植物在胁迫条件下，能够激活拥有去除此类活性氧种类的酶系统来提高抗性。近年来的研究显示，ROS不仅仅是代谢产生的副产品，还能够组成细胞信号转导和调控的系统。

而ROS能够在植物受到外界胁迫时起到防御作用还是毒害作用，完全取决于ROS调控内稳态的结果。植物在受到外界胁迫条件下，为了使ROS维持在细胞内正常可控水平免受其伤害，自身进化出一套防御系统，包括抗氧化酶系统。

SOD、CAT和POD都是植物细胞内膜脂过氧化防御系统的重要的酶，其中SOD是一种典型的清除酶，主要功能是催化超氧物阴离子自由基O2发生歧化反应转换成H2O2，从而清除O2，POD和CAT，将其转换成H2O和O2，这两种酶的活性水平一般被用来评估植物受胁迫程度。

这三种酶在植物体内作用协调一致时。ROS就能维持在一个较低的水平。SOD/CAT和SOD/POD的比值都减小，那么SOD分解产生的H2O2能比较及时地清除。

种子萌发3d后，挑选根伸长一致的大豆幼苗转移到0.5mMCaCl2简单营养液中培养12h，处理前用记号笔在幼苗根基处轻轻作一标记，将做好标记的幼苗转移到含有AlCl3或Ca2 的简单营养液中，每隔3h测定一次根伸长，计算相对根伸长量。

Ca2 对不同时间Al胁迫下相对根伸长的影响，外源1.0mMCa2 处理根伸长抑制的缓解作用随时间的延长而随之变化，30μMAl处理之后根伸长迅速下降，而Ca2 处理对Al诱导根伸长抑制的缓解作用随着时间的延长，逐渐减弱。

活性氧积累是Al胁迫诱导的早期症状之一，这一植物新陈代谢中的毒副产品对植物细胞膜造成严重伤害。为了研究Ca2 与Al诱导产生的氧化胁迫之间的关系，我们检测了1.0mMCa2 处理之后大豆根尖MDA的含量变化。

30μMAl处理12h后，大豆根尖MDA含量显著提高，达对照的1.6倍。铝胁迫下施加外源Ca2 可明显降低大豆根尖内MDA的积累水平。

可以看出，Al胁迫可诱导大豆根尖H2O2的积累，本实验条件下，Al处理12h，H2O2含量达到峰值，为对照的6.45倍，而后开始下降，至24h，降为23.8μmol.g-1FW，但仍是对照的4.76倍。

外源1.0mMCa2 处理4h诱导H2O2水平升高达到16.8μmol.g-1FW，之后随着时间延长逐渐下降，至24h达到11.7μmol.g-1FW。为Al Ca共处理之后大豆根尖内H2O2含量在4h为24.3μmol.g-1FW，是对照的5.1倍。

随着处理时间延长逐渐下降，至24h，降为17.2μmol.g-1FW，与单独Al处理相比，降低了38%，以上结果说明Ca2 能够缓解Al诱导的氧化胁迫及H2O2的积累。

外源水杨酸和钙离子对铝胁迫下大豆根尖抗氧化系统酶活性的影响结果。SOD能催化超氧阴离子自由基O2-转变为H2O2和O2。铝胁迫可诱导大豆根尖SOD活性提高，且随时间延长而逐渐增加。

与单独Al处理相比，Al胁迫下外源加入1.0mMCa2 处理0.5h后，SOD的活性仅有少量提高，其后则无明显变化；外源加入10μMSA处理，可显著提高Al胁迫诱导的SOD活性，并在4h达到峰值，之后下降。

与 Al处理相比，Al VP处理24h后，SOD活性下降了44%，而在Al VP溶液中加入SA共处理后，SOD活性又提高了34%，说明SA可缓解因VP而抑制的SOD活性。

POD是过氧化氢的清除酶，能将H2O2降解为H2O和O2。Al处理后大豆根尖POD的活性随时间的延长逐渐升高；与Al处理相比，加入Ca2 处理4h后其活性有所提高，加入10μMSA4后大豆根尖POD的活性有所提高，Al VP处理24h之后其活性下降了60%。

而在Al VP处理液中加入SA后其活性提高了89%，表明SA可以缓解VP抑制的POD活性，说明Ca2 功能受到抑制时SA可以提高POD的活性。

Al处理显著增加了大豆根尖APX的活性；加入Ca2 处理4h后APX活性明显提高；与Al处理相比，加入10μMSA处理4h后APX活性同样增强，之后随着处理时间的延长大豆根尖APX的活性无显著差异，Al胁迫下加入PAC和VP后的APX活性水平同样无明显差异。

但在Al VP处理液中加入SA分别处理4h和24h后，AXP活性分别呈现下降和上升的趋势。综上所述，以上试验结果说明SA与Ca2 能够改变SOD、POD和APX的活性而降低大豆根尖内H2O2的积累，降低了Al诱导的氧化胁迫伤害，从而发挥耐Al的作用。

Al胁迫对大豆根尖细胞线粒体分布的影响。正常状态下，大豆根尖细胞内的线粒体分布比较均匀，但当30µMAl处理12后，线粒体的分布则发生了明显变化，Al胁迫下大豆根尖细胞内的线粒体都聚集在细胞壁附近明线粒体受到Al胁迫刺激后，向细胞的―安全端移动。

为进一步研究Al胁迫对大豆根尖细胞线粒体数量的影响，探讨线粒体受到Al胁迫后是否通过数量增多来提高其对外界刺激的响应。本实验采用悬浮细胞培养法、通过荧光显微镜对Al胁迫及外源Ca2 对线粒体数量的影响进行了观察。

Al胁迫可显著提高大豆根尖细胞线粒体的荧光强度，为对照的4.85倍，说明线粒体的数量也随之升高。外源Ca2 也可提高大豆根尖细胞线粒体数量，而 Al VP的实验结果则进一步说明了Ca2 影响Al诱导大豆根尖细胞内线粒体的数量变化。

30μMAl胁迫使磷脂酶C、磷脂酶D活性显著降低，说明Al胁迫可以影响磷脂酶C、磷脂酶D的活性；外源Ca2 则可提高其二者的活性，而Al VP处理显著降低酶活性的实验结果则进一步说明了Ca2 对于大豆根系磷脂酶C和磷脂酶D的活性有着一定的影响。

30μMAl处理0.5h显著降低plc、pld的相对基因表达量，且随着时间延长逐渐下降，说明Al胁迫可以影响磷脂酶基因表达量；加入外源Ca2 可以显著提高二者基因表达量，而Al VP处理降低了基因表达量的结果则进一步说明了Ca2 对磷脂酶基因表达的影响。

研究发现，激活产生ROS，诱发导致氧化胁迫损伤，是许多生物及非生物胁迫的共同特性。Al胁迫能诱导许多作物如大豆、水稻和决明等产生氧化胁迫伤害。在一系列的调查中显示，Al胁迫下抗氧化系统酶的激活被人们证实是抗Al机制之一。

在本研究中，SA和Ca2 可以缓解Al抑制的根伸长，同时可以降低MDA和H2O2的积累，说明Ca2 和SA可缓解Al诱导的氧化胁迫伤害。

Dat等研究表明，热胁迫可以快速的诱导芥末苗的内源H2O2含量，以此提高了芥末苗的耐热性。土豆的耐热性和耐冷性也可以通过外源H2O2处理来提高。此类现象说明，植物在抗逆方面的作用可能与其诱导H2O2的产生有关。

本文中实验结果显示，Al胁迫诱导H2O2的产生并在12h达到峰值，外源Ca2 处理0.5h开始H2O2含量升高，至4h达到最高值后开始下降，随着处理时间的延长，Ca2 降低了Al诱导H2O2的积累。

说明Ca2 的施加促进了O2-转化成H2O2造成含量升高，接着H2O2分解生成H2O和O2，即后期H2O2含量下降。

上述结果说明，Al处理之后的大豆根尖内源Al含量增多，导致了H2O2的含量升高，使得植物受到氧化损伤，破坏了细胞质膜完整性，同样也提高了O2-和H2O2的产量以及分布。Al胁迫条件下，Ca2 大大的降低了根部H2O2的积累。

因此H2O2产量的降低则是Ca2 对Al毒缓解作用的主要原因之一。这个作用可能与Ca2 对Al毒抑制根伸长的缓解作用、降低MDA的含量等相关。

已有的研究表明，大多数植物中例如大豆及烟草等，受到Al胁迫时产生大量的ROS，而SA恰好能够调节抗氧化系统酶的活性来改变细胞内H2O2的水平，SOD、CAT以及POD等抗氧化酶可以清除氧自由基，是植物中的重要保护酶并与植物的抗逆性有着紧密的联系。

Yamamoto等人提出Al引起活性氧的积累导致了根伸长的抑制。Yang等人的研究认为，Al胁迫下外源SA提高植物的抗Al性是由于一方面SA可以促进Al诱导柠檬酸分泌，缓解根伸长抑制，另一方面SA可以通过调控抗氧化系统酶如POD等的酶活性来缓解氧化胁迫伤害。

经过SA预处理之后的水稻可以使镉诱导抗氧化系统酶活性的升高，以此缓解氧化胁迫从而提高水稻的耐镉性。而Kang等发现，施用外源SA可以提高香蕉的抗冷性，而在加入H2O2清除剂之后，SA诱导的抗冷性受到抑制。

在植物叶片中H2O2作为第二信使，能够激活相关防御基因并且提高SOD和POD的活性，同时略微降低CAT和APX的活性。

有研究结果证明，植物中H2O2含量增多会导致SA抑制CAT和POD酶的活性并且这种抑制作用可能会导致细胞内H2O2的浓度升高。说明SA在植物抗逆反应中同样与H2O2含量的关系十分重要。

Yamamoto等研究结果显示，Al毒诱导植物线粒体功能损伤，抑制植物呼吸作用，并在其过程中降解ATP抑制根伸长及细胞生长。长时间以来，线粒体被认为是细胞中的―能量库。然而线粒体并不是只有一个生产ATP的功能。

哺乳动物中线粒体积极参与到对胞质内Ca2 的调节过程中。植物中的线粒体与动物中的一样有―能量库来调控Ca、Mg以及磷酸盐的积累。如果其中一种离子缺失，植物在酸性环境下能够将营养元素集中在一起来吸收膜运输的特性。

Marnie等研究结果显示，Ca2 进入到线粒体内需要以下几个条件：能量代谢调节、胁迫条件下Ca2 的预积累以及由于Ca2 增多而引起的PCD的激活。目前研究者着重于研究线粒体的生理功能，以及对于线粒体吸收和分泌Ca2 重要性的研究。

线粒体运输Ca2 的主要场所为TCA循环，其限速酶均可以被Ca2 相关过程所调控。在肾上腺皮层细胞中，人们观察到伴随着Ca2 水平上升，NADH的荧光强度升高。所以线粒体决定着Ca2 的特征同时，在Ca2 信号系统中有着功能性的影响。

因此，本文通过研究Al胁迫对线粒体的影响，来探讨线粒体在耐Al机制的作用。研究结果显示：Al处理之后大豆根尖细胞内线粒体在细胞壁附近聚集，当采用悬浮细胞培养法后用荧光显微镜观察线粒体数量变化后发现。

Al胁迫下大豆根尖细胞内线粒体荧光强度增强，数量增多，外源Ca2 处理后的大豆根尖细胞内线粒体数量同样增多，而VP则降低了线粒体的数量，提示Ca2 能够促进Al诱导大豆根尖细胞内线粒体增多。

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