巨细胞病毒感染的功效与作用
巨细胞病毒感染的功效与作用简介
【概述】CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。【诊断】单靠临床表现不能诊断CMV感染，从临床标本中分离出病毒，同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高，将有助于..
巨细胞病毒感染的功效与作用
【概述】
CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。
【诊断】
单靠临床表现不能诊断CMV感染，从临床标本中分离出病毒，同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高，将有助于诊断。
（一）标本的采集及处理
采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层（buffycoats）可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。
尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂，因此需用聚乙二醇（PEG6000）进行预处理：50μl尿上清与50μl20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。
1．由血液标本制备模板DNA
方法B：由血沉棕黄层（BCP）制备：①用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。②加入500μl 6mol/L盐酸胍，匀浆。③ 加入30μl 10mmol/LEDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml），混合均匀，60℃反应1h。④加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA中。置4℃备用。
2.由冰冻组织标本制备模板DNA：①用恒冷切片机切取一块5～10μm冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。②加入10%用缓冲液配制的福马林。③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/LEDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使刚好浸没沉淀物（约50～100μl）；将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧离心收集上清，取1～10μl 即可进行PCR扩增。
3.由尿液标本制备模板DNA：①100μl尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍，7μl 2mol/L NaCl和20μl玻璃粉悬液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。②室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/LTris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。④同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸馏水，于55℃作用15min。⑥15000r/min离心2min，收集上清（含HCMV DNA），进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。
（三）引物及探针
（四）PCR扩增步骤
1．10×反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/LKCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明胶。
Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。
10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。
引物：100pmol/L。
2．常规PCR扩增
10×反应混合物（50μl）反应缓冲液5μl
10×dNTP 5μl
模板DNA5μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)
引物各0.5μl
蒸馏水 3.8μl
加1～2滴矿物油。
将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃30s，55℃ 40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。
表3 CMV PCR扩增所用的引物及探针
3．套式（nested）PCR扩增：①反应混合物的组成同（2），仅引物为IE2a和IE4b（包括了整个外显子3，共721b），各100pmol。于94℃60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。② 取2μl上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后，于94℃60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。
（五）产物鉴定
扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。
1． 固相杂交：
① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。②加入标记探针（10cpm/μg，2ng/ml），杂交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④自显影。
2． 液相杂交及电泳分析：
① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。②加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20μl。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。
HCMV DNA分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。
在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。
PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMVDNA序列的水平；利用该系统，在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出，较斑点印迹杂交提高2×103倍。
PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生优育也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者，PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种抗病******物疗效的手段。
【治疗措施】
巨细胞病毒感染的治疗，可应用各种抗病毒制剂如GCV、抗巨细胞病毒的免疫球蛋白制剂、干扰素及转移因子等。但这些药物并不能解决根本问题，往往停药后病毒又潜伏地回升，鉴于此种病毒可能作为艾滋病的病因之一，各国学者均在致力于控制其感染的研究。最近，美国学者研制出两种活疫苗，初试后颇见效。一种是由AD169菌株研制成的；另一种是从TOWn菌株制成的，经非肠道给药后，已明显表现出有抗巨细胞病毒的效能，CMV抗体升高，导致免疫功能增强。
【病原学】
CMV属于疱疹病毒群，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，其形最大由162个壳粒（capsomer），正20面体构成。有典型的疱疹病毒结构。CMV只能在人纤维母细胞培养中增殖，而不能在其他动物细胞中生长，增殖非常缓慢，初次分离需一个多月才能出现特殊的细胞；细胞变园，膨胀，细胞及核巨大化，核周围出现一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。
CMV在20%乙醚中最多存活2小时。pH
